lncRNA芯片

• 简介
• 芯片特点
• 实验流程
• 结果展示
• 客户案例
• SCI成果

•        长链非编码RNA (LncRNA)是一类长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明：LncRNA广泛参与各种生物学过程，LncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。通过LncRNA芯片，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的LncRNA的表达变化，从而为后续的LncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大的便利。

         Arraystar LncRNA芯片可同时检测LncRNA和mRNA，这一突破性芯片平台的构建，使Arraystar成为LncRNA研究领域的先驱和领导者。迄今为止，康成客户采用Arraystar LncRNA芯片已发表的SCI论文已超180篇，其中多篇发表在Cancer Cell，Mol Cell，Hepatology，Blood，EMBO等国际顶尖杂志上。

  康成生物是Arraystar中国区唯一代理商，独家为您提供Arraystar公司长链非编码RNA芯片全程一站式技术服务。您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。同时，根据您的研究需要，康成还提供各种深入数据挖掘服务。

  Arraystar公司LncRNA芯片产品列表

  服务	芯片	规格	描述
  Human LncRNA Microarray Service	Human LncRNA Array V4.0	8x60K	LncRNAs (40173) + coding genes (20730)
  Mouse LncRNA Microarray Service	Mouse LncRNA Array V3.0	8×60K	LncRNAs (35923) + coding genes (24881)
  Rat LncRNA Microarray Service	Rat LncRNA Array V2.0	4×44K	LncRNAs (13611) + coding genes (24626)

• • 检测lncRNA表达量灵敏度高、技术最成熟：lncRNA表达水平比mRNA低，芯片比RNA-seq更适合对低丰度RNA分子的检测。
  • 收录lncRNA更新最及时，覆盖最全面、最可靠：可同时检测lncRNA和编码蛋白的mRNA。
  • 系统而实用的lncRNA注释：注释LncRNA基因组信息、分类及潜在的调控机制，为深入研究lncRNA复杂生物学功能提供参考信息。
  • 转录本特异型的探针设计：Arraystar lncRNA芯片采用转录本特异性的探针设计，对不同转录本检测更准确、特异性更高。
  • 提供丰富的数据信息：用于调控型lncRNA与编码蛋白的mRNA之间共表达及关联研究。

• 1.样品总RNA抽提

        若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
        若实验对象为细胞样品，每份样品取1×10⁶~1×10⁷细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
  2. RNA质量检测
         使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
         使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性
  3. cDNA样品合成和标记
  4.标记效率质量检测
         使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。
  5.芯片杂交
         在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。
  6.图像采集和数据分析
         使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
  7.提供实验报告
         芯片扫描图
         实验方法中英文报告
         RNA质检报告
         芯片数据结果报告，包括差异表达LncRNA列表，差异表达基因列表

  
  

  

  常规lncRNA芯片研究流程

  
  

• 基本数据分析

  1.  差异LncRNA的筛选

         对于每个实验组有三次及三次以上生物学重复的实验设计，我们应用T检验筛选任意两个实验组之间差异表达的LncRNA，方差分析（ANOVA）则用于从三个以上实验组筛选差异表达的LncRNA，并以邻近（<100kb）mRNAs进行注释。康成生物除了提供常规的通过p值筛选的差异LncRNA，还提供通过   FDR筛选的差异LncRNA。与p值筛选相比，FDR筛选对多重筛选过程中的假阳性率进行控制，是一种更加严谨的筛选方法，更适合于生物学重复较多的临床样本。

         适用范围：一般用于两组或多组实验状态下的比较，建议每组实验至少有3次生物学重复。

  

  
  

  2.  差异表达的LncRNA的聚类图

         为了全面而直观地展示样品之间的关系及基因表达差异情况，将表达基因做层次聚类分析。用挑选的基因的表达情况来计算样品直接的相关性。一般来说，同一类样品能通过聚类出现在同一个簇（Cluster）中，聚在同一个簇的基因可能具有类似的生物学功能。

         适用范围：两组或多组样品的表达谱数据

  

  
  

  3.  差异LncRNA的邻近基因分析

         很多LncRNA是通过调控邻近发挥生物学功能，因此通过邻近基因的分析可以为后续LncRNA的功能研究提供线索。康成生物将差异LncRNAs数据与其临近（< 100 kb）mRNAs的差异表达数据整合，以期提供LncRNAs的功能推断。

         适用范围：两组或多组数据比较获得的差异LncRNA

  1) GO分析

         Gene Ontology（简称GO）是基因功能国际标准分类体系。GO可分为分子功能（Molecular Function），生物过程（Biological Process）和细胞组成（Cellular Component）三个部分。康成生物对位于差异LncRNA附近（< 100 kb），并且差异表达的蛋白编码基因进行了GO分析。这一方面便于客户从整体上了解差异LncRNA所涉及的GO条目，另一方面也为客户挑选LncRNA提供了线索：客户可以挑选与感兴趣的GO条目相关的差异LncRNA进行后续研究。

  

  
  

  2) Pathway分析

         康成生物对位于差异LncRNA附近（< 100 kb），并且差异表达的蛋白编码基因进行了Pathway分析。这一方面便于客户从整体上了解差异LncRNA所参与的信号通路，另一方面也为客户挑选LncRNA提供了线索：客户可以挑选与感兴趣的信号通路有关的差异LncRNA进行后续研究。

  

  
  

  4.  LncRNAs的子类分析

         适用范围：两组或多组数据比较获得的差异LncRNA

  （1）差异antisence LncRNAs与相应mRNAs联合分析

         在LncRNA中，研究得比较深入的是反义（Antisense） LncRNA，有超过30%的已注释的人类转录本有相应的反义LncRNA。这些反义LncRNA通过多种机制在转录水平或转录后水平调控相应的正义（sense）mRNA，从而发挥生物学功能。如下图中反义LncRNA诱导染色质和DNA的表观遗传改变，从而影响相应的正义mRNA的表达。康成生物将差异antisense LncRNAs与相应的sense mRNAs信息进行整合，以推断LncRNAs的功能.

   

  *图释：反义LncRNA诱导染色质和DNA的表观遗传改变，从而影响相应的正义mRNA的表达。

   

  
  

  （2）差异Enhancer LncRNAs与相应mRNAs联合分析

         LncRNA可以发挥类似增强子的功能，增强邻近蛋白质编码基因的表达，从而在发育和分化等过程中发挥关键作用。康成生物对Ørom UA等人在人类细胞系中发现的3千多条具有增强子功能的LncRNA 进行了详细的注释，并将差异的Enhancer LncRNAs与相应的mRNAs(<300kb)进行了整合，以帮助客户推断这些LncRNAs的功能。

  

  *图释：LncRNA作为增强子，增强邻近蛋白质编码基因表达水平；下图：经siRNA敲除ncRNA后，邻近蛋白质编码基因表达水平下降

  

  
  

  （3）差异LincRNAs与相应mRNAs联合分析

         lincRNAs是目前研究的热点之一。康成生物根据Rinn等构建的lincRNAs数据库，将芯片中符合标准的差异LncRNA挑选出来与相应mRNA（< 300 kb）进行联合分析，以推断lincRNA功能。

  

  
  

  高级数据分析

  1. CNC（coding-noncoding gene co-expression）分析

         CNC分析是一种通过LncRNA和mRNA共表达数据，将LncRNA与mRNA联系起来的分析方法。通过CNC分析可以发现与某个LncRNA具有相同表达模式的mRNA，通过这些mRNA的功能，可以将LncRNA与特定信号通路或疾病状况联系起来，从而便于预测LncRNA的功能，并揭示其作用机制。

         适用范围：芯片数量≥6张

         康成生物CNC分析结果展示，下图数据来源于康成客户已发表的文献（Hepatology，影响因子：12.003）：

  

  *图释：LncRNA-HEIH在HCC中的共表达网络。黄色的节点代表LncRNA，绿颜色的节点代表与肿瘤生长和药物耐受相关的蛋白编码基因，紫色节点代表功能未知的蛋白编码基因。

  
  

  2. 生物标志物分析

         康成生物还为客户提供包括课题设计到最终数据分析在内的一站式biomarker分析，以最常见的筛选预后biomarker为例，我们首先通过Cox回归模型筛选预后相关的LncRNA，然后通过Logistic regression，Nearest Template Prediction (NTP)等多种统计学方法构建预测模型，然后从中挑选出效果最好的预测模型用于后续分析。无论是LncRNA的筛选，还是预测模型的建立，都及其严谨和科学，能最大限度的为客户发表文章提供帮助。

  
  

  
  

  
  

• 1. LncRNA生物标记物案例分析 

  LncRNA胰腺癌诊断生物标记物筛选（Expression profile of long non-coding RNAs in pancreatic cancer and their clinical significance as biomarkers. Oncotarget, 2015）
         该研究首先通过Arraystar LncRNA芯片对胰腺癌和慢性胰腺炎组织（8 vs. 4）中的LncRNA表达谱进行了检测，找到了33个在胃癌中差异表达的LncRNA。之后作者从上调最明显的LncRNA中挑选了三个（XLOC_006390, HOTTIP-005和RP11-567G11.1），在144个临床组织样本中进行了qPCR验证，锁定了HDRF和RDRF（HOTTIP-005和RP11-567G11.1来源的RNA片段）。结合qPCR的数据和临床信息，进一步在胰腺癌（n=122）和正常对照（n=127）的血浆样本中验证了HDRF和RDRF的诊断潜能。实验证明，HDRF和RDRF与胰腺癌发生密切相关，是潜在的诊断和预后marker。 

  
  

  2. LncRNA生物标记物和功能机制联合研究案例 

  LncRNA-NKILA作为乳腺癌预后生物标记物和其在NF-κB信号通路及乳腺癌转移中的功能机制研究（A Cytoplasmic NF-κB Interacting Long Noncoding RNA Blocks IκB Phosphorylation and Suppresses Breast Cancer Metastasis [J]. Cancer Cell, 2015） IF: 23.523
         该研究首先通过Arraystar LncRNA芯片检测了多种炎症因子((TNF)-a, IL-1b和LPS)处理的乳腺癌细胞(MDA-MB-231)中的lncRNA表达谱，并找出了23个上调10倍的lncRNAs和28个下调10倍的lncRNAs。其中，NKILA在三组炎症因子处理中均上调12倍以上，因此，作者选择NKILA作为研究对象。临床研究中，作者利用qRT-PCR在上千例乳腺癌组织中检测NKILA的表达情况，并结合临床数据进行分析，结果表明：NKILA高表达与乳腺癌预后不良显著相关，是潜在的乳腺癌预后marker。功能机制研究中，作者在细胞系和小鼠模型中进行NKILA的敲除和过表达，验证其生物学功能，并进一步通过RIP、RNA pull down等实验探索其分子机制，结果表明：NKILA能够与NF-κB通路相互作用，通过结合NF-κB/IκB抑制了IKK诱导的IκB磷酸化，使得NF-κB信号通路失活，从而抑制乳腺癌肿瘤转移。

• → A novel lncRNA GClnc1 promotes gastric carcinogenesis and may act as a modular scaffold of WDR5 and KAT2A complexes to specify the histone modification pattern. Cancer discovery. 2016

  → Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion. Nature Communications. 2017

  → Long Non-coding RNA DILC Represses Self-renewal of Liver Cancer Stem Cells via Inhibiting Autocrine IL-6/STAT3 Axis. Journal of Hepatology 2016

  → Long non-coding RNA LINC00092 acts in cancer-associated fibroblasts to drive glycolysis and progression of ovarian cancer Cancer Research 2017

  → A novel oncogene, promotes proliferation and metastasis by activating the VEGF pathway in gastric cancer. Oncogene. 2017

  → The TMSB4 Pseudogene LncRNA Functions as a Competing Endogenous RNA to Promote Cartilage Degradation in Human Osteoarthritis. Molecular Therapy. 2016

  → A novel lncRNA uc. 134 represses hepatocellular carcinoma progression by inhibiting CUL4A-mediated ubiquitination of LATS1. Journal of Hematology & Oncology. 2017

  → Up-regulation of lncRNA CASC9 promotes esophageal squamous cell carcinoma growth by negatively regulating PDCD4 expression through EZH2. Molecular Cancer. 2017

  → Long non-coding RNA LINC00161 sensitises osteosarcoma cells to cisplatin-induced apoptosis by regulating the miR-645-IFIT2 axis. Cancer Letters. 2016

  → Circulating “lncRNA OTTHUMT00000387022” from Monocytes as a Novel Biomarker for Coronary Artery Disease. Cardiovascular Research. 2016

  → DC-SIGNR by influencing the lncRNA HNRNPKP2 upregulates the expression of CXCR4 in gastric cancer liver metastasis. Molecular Cancer. 2017

  → Microarray analysis of long noncoding RNA and mRNA expression profiles in human macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. Scientific Reports. 2016

  → LncRNAs expression profiling in normal ovary, benign ovarian cyst and malignant epithelial ovarian cancer. Scientific Reports. 2016

  
  

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