SAB功能分类PCR芯片

• 简介
• 产品特点
• 实验流程
• 结果展示
• 客户实例
• SCI成果

•        功能分类基因芯片是生物学通路研究的重要工具。这种芯片将微列阵技术与特定生物学通路（specific biological pathways）的最新知识有机结合,可以大大缩短发现诊治各种疾病的生物学标志物(biomarkers)的时间。芯片上的基因包括了那些与研究对象有确定关系的基因，或至少是与研究对象的关系有待考证的基因。如果研究对象是某一生物学通路的基因，则使用针对该类基因的功能分类基因芯片比使用高密度表达谱芯片更加有效便利。
         美国SABiosciences公司（原SuperArray公司）设计了超过100种功能分类芯片，涵盖生命科学研究的各个领域，在国际上处于领先地位。 其开发的第二代功能分类基因芯片（Real-time PCR芯片），可在一次实验中准确检测上百个基因的mRNA水平，并且将检测精度提高到与实时定量PCR相当的水平。功能分类PCR芯片：灵敏度高，样品的使用量低，每张芯片使用的总RNA最少可为0.5ng；可观察到的动态线性范围超过105，可以同时检测表达量差异较大的基因；重复性高，Ct值的平均差异只有0.25个循环；分辨率高，可检测超过两倍的基因表达量变化；特异性好，PCR扩增产物条带单一。SABiosciences公司设计了超过100种功能分类PCR芯片，涵盖生命科学研究的各个领域。
         SABioscienses还提供芯片定制服务（Custom PCR Arrays）。定制PCR芯片是根据不同研究需要量身定做的PCR芯片。定制PCR芯片被广泛应用于基因表达谱结果验证及特定信号通路的研究等。同时，它还特别适合于大样本的生物学标记物研究，无论这些生物学标志物是来自于研究者的前期研究成果、各种文献报道、还是表达谱芯片筛选的结果，SABiosciences都能够灵活设计出符合需要的定制PCR芯片，获得高精确性、高灵敏度，高重复性的实验结果，缩短生物学标志物筛选的进程。

  康成生物为您提供SABiosciences公司第二代功能分类基因芯片——实时定量PCR芯片技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成，使用的定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM® 7700或ABI PRISM® 7900。PCR芯片技术服务的主要流程包括：RNA抽提、RNA质量检测、cDNA模板制备、实时定量PCR、数据处理及制作实验报告。
• • 灵敏度高：样品的使用量低，每张芯片使用的总RNA最少可为0.5ng；
  • 动态线性范围超过105：可以同时检测表达量差异较大的基因；
  • 重复性高：Ct值的平均差异只有0.25个循环；
  • 分辨率高：可检测超过两倍的基因表达量变化；
  • 特异性好：PCR扩增产物条带单一。
  • 数据全面、可靠：芯片包含的基因来自公共权威数据库、权威综述和相关文献挖掘
  • 覆盖度高：SABiosciences公司设计了超过200种功能分类PCR芯片，涵盖生命科学研究的各个领域（详见列表）。
  • 对照全面：5个管家基因，1个基因组DNA对照（GDC），3个反转录对照（RTC）和3个PCR对照（PPC）

• 1.样品RNA抽提
         a. 实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（Invitrogen），使用Mini- Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。
         b. 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，加1ml的RNA抽提试剂TRIzol（样品为贴壁细胞，每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml），裂解后抽提RNA。
  2.DNase I消化RNA样品
         DNase I在370C温育处理RNA样品，去除RNA抽提过程中可能混入的的基因组DNA。
  3.RNA纯化
         RNeasy® MinElute™纯化试剂盒（Qiagen）对DNase I处理的RNA样品纯化回收，已得到单纯的RNA样本。
  4.RNA质量检测
         a) 使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
         b) 用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。
         c)  提供RNA QC报告。
  5.cDNA合成
         按照逆转录酶（Invitrogen或Promega）使用说明将样品RNA逆转录为cDNA (根据样品RNA质量选用oligo dT或随机引物)。
  6.实时定量PCR
         按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中，然后再含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液，进行实时定量PCR反应。
  7.数据分析
         利用配套软件计算PCR芯片中的各个基因的Ct值，采用公认的DDCt方法比较基因的表达变化。
         a. 计算每个处理组中的每个通路相关基因的ΔCt。
         ΔCt(Ctrl) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Ctrl array
         ΔCt (Exp) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Exp array
         b. 计算2个PCR Array中每个基因的ΔΔCt。
         ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)
         c. 通过2-ΔΔCt计算Exp（实验组）与Ctrl（对照组）间基因的表达差异。
  8.提供实验报告
         Gene table（96孔板个基因列表）
         Excel芯片结果汇总表（包括芯片原始结果、数据分析和各种图表）

  
  

  
  

• 1.基因表达数据列表
         表达有差异（>2倍）或有显著性（P<0.05）的数据用有颜色的字体标注，客户可以很方便的根据自身要求，利用倍数变化或P值在列表中筛选靶基因。

  

  *图释：表达倍数大于2倍，或p值小于0.05的数据用带颜色的字体标注。客户可以根据自身要求利用倍数变化或P值筛选靶基因

  
  

  2.散点图

         客户可以根据三点图直观的看到表达上下调的基因，及其上下调程度

  

  *图释：位于灰色条带上方的是上调倍数大于2倍的基因，位于灰色条带下方的是下调倍数大于2倍的基因

  
  

  3.3D图

         可以直观的了解表达上下调的基因，及其在PCR板上的位置

  

  *图释：纵轴为基因表达倍数变化，横纵轴分别代表相应基因在PCR板上的位置。

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

  
  

• 1.功能分类PCR芯片揭示CENP-A调控肝癌的分子机制

  ShRNA-Targeted Centromere Protein A Inhibits Hepatocellular Carcinoma Growth.PLOS ONE, 2012) 

         CENP-A是一个保守的着丝粒蛋白，在癌症中高表达，是恶性肿瘤的“Hallmark”。在肝癌组织中，CENP-A的mRNA水平和蛋白水平明显高于癌旁组织。RNAi和过表达实验显示CENP-A能够促进细胞从GO/G1期进入S期，从而促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。但是CENP-A调控细胞周期的分子机制仍不清楚。

         为了揭示CENP-A调控细胞周期的分子机制，作者使用Human Cell Cycle PCR芯片检测92个与细胞周期相关的基因表达水平。相对于对照肝癌细胞，在CENP-A RNAi的肝癌细胞中，3个基因显著上调，17个基因显著下调。3个上调基因与细胞周期负调控有关，而下调显著的基因与细胞周期进程密切相关。在上述相同的细胞中，通过western blot检测5个显著差异基因的蛋白水平变化，其变化趋势与mRNA变化趋势一致。从而揭示了CENP-A通过调控与细胞周期有关基因的表达从而调控肝癌细胞增殖和凋亡的分子机制。

  技术路线

  
  

  
  

  结果展示

  

  *图释：CENP-A RNAi导致的细胞周期相关的差异表达基因

  
  

  
  

  2.功能分类PCR芯片揭示EIF5A2促进结肠癌转移的分子机制

  Ovreexpression of EIF5A2 promotes colorectal carcinoma cell aggressiveness by upregulating MTA1 through C-myc to induce epithelialemesenchymal transition.Gut.2011
         EIF5A2是一个重要的抑癌基因，其在结肠癌组织中表达水平明显升高，并且高水平EIF5A2结肠癌患者预后较差。通过RNAi和过表达实验，EIF5A2能够促进肿瘤细胞侵袭和转移，并且能够促进结肠癌细胞上皮间质转化。但是EIF5A2影响结肠癌的分子机制仍不清楚。

         为了揭示EIF5A2促进肿瘤细胞侵袭和转移的分子机制，作者使用human tumour metastasis PCR芯片检测与肿瘤转移相关的84个基因的表达水平。比较EIF5A2过表达的结肠癌细胞和对照结肠癌细胞发现：过表达EIF5A2显著上调MMP2, IGF1, METAP2 和 MTA1，显著下调NR4A3 和 CTNNA1。Western blot检测差异表达基因，其中在过表达EIF5A2的结肠癌细胞中，MTA1蛋白水平明显上升，CTNNA1蛋白水平明显下降。免疫组化显示MTA1与EIF5A2表达水平密切相关。进一步作者通过RNAi和过表达实验，确认MTA1能够促进肿瘤转移和上皮间质转化。ChIP实验结果显示，在EIF5A2过表达的结肠癌细胞中，更多c-myc结合在MTA1启动子区域，从而促进MTA1表达。从而揭示了EI5A2通过上调MTA1促进结肠癌转移的分子机制。

  
  

  技术路线

  

  
  

  结果展示

  

  *图释：Human tumour metastasis RT2 PCR芯片结果列表

  
  

  
  

  
  

  
  

• → Mitochondrial genome sequencing of chondrocytes in osteoarthritis by Human Mitochondria RT2 Profiler™ PCR Array. Molecular Medicine Reports. 2015

  → Toxoplasma gondii isolate with genotype Chinese 1 triggers trophoblast apoptosis through oxidative stress and mitochondrial dysfunction in mice. Experimental Parasitology. 2015

  → Water-Soluble Ruthenium(II) Complexes with Chiral 4‑(2,3-Dihydroxypropyl)-formamide Oxoaporphine (FOA): In Vitro and in Vivo Anticancer Activity by Stabilization of G‑Quadruplex DNA, Inhibition of Telomerase Activity, and Induction of Tumor Cell Apoptosis.  Journal of Medicinal Chemistry. 2015

  → Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumor Biology. 2014

  → Rapamycin inhibits pre-B acute lymphoblastic leukemia cells by downregulating DNA and RNA polymerases. Leukemia Research. 2014

  → Peritumoral neutrophils link inflammatory response to disease progression by fostering angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 2011

  → ShRNA-Targeted Centromere Protein A Inhibits Hepatocellular Carcinoma Growth. Plos One. 2011

  → Zhang, L., et al., Escin attenuates cognitive deficits and hippocampal injury after transient global cerebral ischemia in mice via regulating certain inflammatory genes. Neurochem Int. 2010

  → The properties of tumor-initiating cells from a hepatocellular carcinoma patient's primary and recurrent tumor. Carcinogenesis. 2010

  → Gene expression profile towards the prediction of patient survival of gastric cancer. Biomed Pharmacother. 2010

  → Effect of burn injury on apoptosis and expression of apoptosis-related genes/proteins in skeletal muscles of rats. Apoptosis. 2009

  → Effects of chronic mild stress on the development of atherosclerosis and expression of toll-like receptor 4 signaling pathway in adolescent apolipoprotein E knockout mice. J Biomed Biotechnol. 2009

  → Identification of liver metastasis-related genes in a novel human pancreatic carcinoma cell model by microarray analysis. Cancer Lett. 2009